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     技術前沿 
    技術前沿
    AEM | 張學禮/畢昌昊聯合使用環狀mRNA為核糖體提供無限翻譯模板
    來源: | 作者:geneseed | 發布時間: 2022-04-26 | 180 次瀏覽 | 分享到:

    生物材料具有獨特的性能和不可替代的應用。纖維蛋白,如各種毛蟲蛋白和蛛絲蛋白,作為一種獨特的生物材料,具有人造材料所沒有的強度和韌性。蜘蛛絲是自然界中最強的纖維之一,是一種具有廣泛應用潛力的生物材料。蜘蛛絲中強度最好的牽引絲由主壺腹腺蛛絲蛋白(MaSp)組成,拖絲MaSp包括MaSp1和MaSp2兩個組成部分。與拖絲相比,鞭毛狀絲(FLAG)的抗拉強度不高,但它具有優良的延展性,使其能夠形成球形網的捕獲螺旋。蜘蛛絲研究的一個主要目標是發展可能的大規模生產技術。然而,由于蜘蛛通常具有攻擊性、領地性,甚至是同類相食的,因此實際上不可能培養野生蜘蛛來生產類似蠶絲的蛛絲。

     

    MaSp1的核心表達模板是一個長且高度重復的DNA序列。DNA模板中重復序列過多,導致DNA重組,基因片段丟失,蛋白質翻譯提前終止。質粒上的重復基因在細菌宿主中是不穩定的,MaSp1類基因在工程菌宿主中的終止錯誤率較高,極大地限制了蛛絲蛋白生產技術的發展。

     

    環狀RNA具有穩定的閉合環狀結構。利用環狀RNA可翻譯的機制,使用mRNA環化技術設計攜帶一個蛛絲蛋白開放閱讀框(ORF)的cmRNA。由于cmRNA的環狀結構,理論上cmRNA為核糖體提供了一個無限的翻譯模板,在核糖體脫離環狀mRNA模板之前會產生長重復肽。

     

    2022年4月6號,天津市工業生物技術研究所的張學禮研究員和畢昌昊研究員Appl Environ Microbiol聯合發表文章Engineering Circularized mRNAs for the Production of Spider Silk Proteins,在該研究中,作者報道了高達~110 kDa的重組MaSp1蛋白和高達~88.2 kDa的重組FSLP(鞭毛狀絲樣蛋白)的生產。

     

     

     

    如圖1所示,為了確保核糖體不翻譯未經加工的線性mRNA的蛛絲蛋白的ORF,核糖體結合序列(RBS)和翻譯起始密碼子ATG位于MaSp1或FSLP編碼序列的下游(圖1A)。因此,調控序列在mRNA環狀化后才位于編碼序列的上游。為了純化得到的MaSp1或FSLP多肽,將His標記加入到ORF中(圖1A)。如果mRNA是環狀的,核糖體可以環繞cmRNA,產生一個長重復多肽(圖1B)。

     

     

    1.基于td側翼內含子環狀蛛絲mRNA的設計

     

    作者對逆轉錄cDNA產物進行針對BSJ位點的qPCR檢測,發現了超過一個循環的DNA 模板。因此,常規的量化方法無法準確對環化產物定量。

     

    作者使用SplintQuant,在此方法中,使用經過修飾的PBCV-1 DNA連接酶,將DNA寡核苷酸靶向直接位于circRNA背離接頭側翼,可以檢測特異性circRNA,其不受同源線性 RNA、含內含子序列的circRNA及目標circRNA的片段大小影響。M13通用引物序列整合到circRNA特異性寡核苷酸的側翼上,就能在沒有逆轉錄(qPCR)的情況下對連接的DNA探針進行定量PCR[1]。對線性轉錄本的環化效率統計發現,MaSp1和FSLP轉錄本環狀化的比例分別為8.5%和36.7%。td外顯子在5’和3’內含子剪接位點之間的最佳長度為300到500個核苷酸,而MaSp1 cmRNA的一個單位只有156個核苷酸,MaSp1 mRNA的大小可能是導致其環化效率較低的主要因素。

     

     

    SplintQuant對cmRNA相對定量

     

    作者使用BL21感受態細胞轉化pcirMaSp1和pcirFSLP質粒,分別培養表達MaSp1和FSLP蛋白。對蛋白產物進行凝膠電泳發現,cmRNA可以為核糖體提供一個環形的翻譯模板,使核糖體能夠持續對模板序列進行翻譯。對蛋白樣本進行WB檢測,MaSp1多肽由大小為5.1 kDa的重復單元組成。MaSp1重復多肽混合物中,最小的條帶約為10 kDa,極有可能是一個二聚體MaSp1肽,而凝膠上最大的可分化條帶約為110 kDa,表明核糖體可以沿著MaSp1 cmRNA移動至少22圈(圖2-Light)。MaSp1多肽FSLP由大小為9.8 kDa的重復單元組成。與MaSp1相似,純化后的FSLP是具有不同重復單元數的FSLP的混合物(圖2-Right)。    

     

     

    2.純化蜘蛛絲蛋白的WB檢測

     

    測定蛋白產物濃度,并對產品效價進行評估,MaSp1和FSLP兩種蛋白的產品滴度分別為22.1 mg/L和81.5 mg/L,細胞干重產率分別為4.4 g/kg和16.5 g/kg。滴度結果4倍的差距,與MaSp1和FSLP的mRNA環化效率8.5%和36.7%一致。作者推測環化效率是影響產品效價的重要因素,mRNA的大小可能導致其循環效率低,導致cmRNA的工作濃度低,產物滴度降低,因此重復單元的長度可能是決定cmRNA是否為表達纖維蛋白的最佳策略的關鍵因素。

     

    與之前的研究(表1)相比,本研究提供了一種簡單的表達重組蜘蛛絲的策略。對于深入研究的MaSp1,與基于長重復DNA模板的生產相比,本研究的生產效價相對較低。然而,對于更大的和新的FSLP的生產,cmRNA表達策略提供了比傳統方法更高的產量。

     

       

    蠶絲凍干樣本

     

     

    1.不同的宿主系統在重組蛛絲蛋白生產中的性能

     

    本研究設計并建立了便于外源表達MaSp1、FSLP等具有串聯重復序列的大蛋白的cmRNA技術,這些蛋白屬于一類性能優越的重要生物材料。cmRNA為核糖體提供了無限的翻譯模板,并產生了長重復肽。利用該技術,分別獲得了大于110 kDa和90 kDa的重組MaSp1和FSLP,二者均包含數十個重復單元。該技術使得人工構建各種蠶絲蛋白和類似結構的蛋白非常方便,且成本和勞動強度最小。這種革命性的技術將使研究人員能夠輕松地構建、研究和實驗大量的絲狀蛋白質,這些蛋白質的序列來自自然基因或人工設計。cmRNA技術將顯著加速纖維蛋白為基礎的生物材料發展。

     

     

    原文鏈接:https://journals.asm.org/doi/10.1128/aem.00028-22

     

    參考文獻:

    [1].Conn V, Conn SJ. 2019. SplintQuant: a method for accurately quantifying circular RNA transcript abundance without reverse transcription bias. RNA 25:1202–1210. https://doi.org/10.1261/rna.070953.119.


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